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      斑馬魚技術 斑馬魚技術介紹

      斑馬魚技術介紹

      它是發育生物學家的得力助手,是醫學研究的后起之秀,是環境監測的哨兵,是指示兵,是藥物研發的新寵,它就是脊椎類模式動物明星斑馬魚(zebrafish,Danio rario)。


      一、斑馬魚基本特點:

              原產地:熱帶淡水魚,原產于喜馬拉雅山南麓的印度、巴基斯坦、孟加拉和尼泊爾等南亞國家。成魚體長3-100px,略呈紡錘形,頭小而稍尖,吻較短,身軀玲瓏而纖細,因其體側具有像斑馬一樣縱向的暗藍色與銀色相間的條紋而得名。



              斑馬魚是體外受精發育,胚體透明。胚胎發育快,受精后3天左右孵化出膜,天左右開口進食,約3個月達到性成熟,壽命可達2年以上。斑馬魚可常年產卵,繁殖周期3-4天,一對成年斑馬魚每次可產卵200-300枚,受精率通常在70%以上。養殖溫度一般在23-31℃,15℃左右仍可存活,最佳養殖溫度在25-28攝氏度之間,pH值在6.8~7.8,硬度在2~6之間。



      二、斑馬魚作為模式生物的起源和發展

            1938 年,美國布朗大學 Roosen-Rung 教授首次報道斑馬魚發育形態學研究成果。

              1950 年代,美國羅格斯大學 K. Kenneth Hisaoka 教授首次報道斑馬魚毒理學研究成果。

              1972 年,美國俄勒岡大學 George Streisinge 教授開始斑馬魚發育生物學研究和模式動物建立工作。

              1989 年,美國俄勒岡大學 Monte Westerfield 教授出版斑馬魚研究圣經 The Zebrafish Book 第一版。

              1998 年,首個斑馬魚模式生物數據庫 ZFIN 成立(http://zfin.org)。

              1998 年,全球第一家斑馬魚藥物研發服務外包公司成立。

              2004 年,斑馬魚國際資源中心(ZIRC)在俄勒岡大學成立。

              2011 年,斑馬魚模型和技術研究被列入中國科技部「重大新藥創制」專項十二五實施計劃。

              2012 年,中國國家斑馬魚資源中心成立。 目前,斑馬魚已經成為繼小鼠和大鼠之后的第三大脊椎類模式生物,在發育生物學、遺傳學、基礎醫學、藥理學、毒理學、藥物研發以及生態環境評價等諸多領域得到了廣泛應用。 


      三、斑馬魚作為模式生物的優勢 

             1、擁有與人相似的組織器官和系統,基因和信號通路與人類高度保守:>87%;生理、發育和代謝與哺乳動物高度相似,美國國立衛生研究院(NIH)將斑馬魚列為繼小鼠和大鼠之后的第三大脊椎模式生物;


             2、斑馬魚是目前唯一適于高通量藥物篩選的脊椎類動物;


             3、個體小(目前唯一適于進行微孔板高通量藥物篩選的脊椎類動物)、發育周期短 (24 小時器官便可形成)、實驗周期短 (篩選結果在一周內即可得出)、費用低(約為鼠類的 1/10~1/100)、體外受精、透明(可直接觀察藥物對內部器官的作用)、單次產卵數較高(150~200 枚)以及實驗用藥量小(為小鼠用藥量的 1/100~1/1000)。 

      四、斑馬魚在基礎研究領域的應用:發育生物學、基因功能研究、疾病發病機制研究等 

            1、斑馬魚可應用于發育生物學的細胞譜系分析、突變鑒別、飽和誘變分析、基因轉移研究、基因連鎖圖的構建,其體外受精、胚體透明、細胞分裂快等特點使它比起大小鼠有獨特優勢。 


            2、基因功能研究:斑馬魚繁殖速度快,能提供足夠量的胚胎用于基因篩選;其胚體透明的特點可以一目了然地觀察到基因突變后的表型變化。 



            3、疾病發病機制研究:斑馬魚的器官發生、疾病生理、基因組與人類相似度較大,主要信號通路和基因具高度同源性,諸多斑馬魚疾病(如血癌、免疫性系統疾病、感染疾病等)模型已建立,利用斑馬魚的疾病模型來研究治愈人類相關疾病是近年全球熱點的科研項目。

       

      五、斑馬魚在藥物研發中的應用 

            斑馬魚模型既具有體外實驗快速、高效、費用低等優勢,又具有哺乳類動物實驗預測性強、可比度高等優點,可以有效彌補體外實驗和哺乳類動物實驗之間的巨大生物學斷層,完善現有藥物研發體系。將斑馬魚模型魚體外實驗和哺乳動物實驗相結合,可以從整體上縮短藥物臨床前早期研發的實驗周期,降低實驗成本,提高實驗預測的準確性,進而提高藥物研發效率,降低藥物研發風險。 

             全球醫藥巨頭輝瑞、羅氏、諾華、葛蘭素史克、阿斯利康等都逐漸開始使用斑馬魚技術進行藥物篩選研發。

              2009 年,斑馬魚藥物毒理學評價技術首次通過 FDA 和 EMA 的 GLP 認證,這標志著斑馬魚模型的安全藥理學和毒理學評價結果可以作為正式材料納入臨床試驗申報資料。

              2013 年,斑馬魚資料首次用于 CFDA 臨床申報,目前,中國使用斑馬魚實驗數據申報 CFDA 臨床試驗批件的新藥研發項目已經有 4 項,2 項已經獲得批件。 美國食品藥品監督管理局(FDA)越來越多地應用斑馬魚對臨床前藥物進行安全性與毒理性評價,并在其官網介紹其研究成果: 


      六、斑馬魚在環境檢測與化學品風險評估中的應用 

            斑馬魚早在 1930 年左右就已經在歐洲用于環境監測。目前 OECD 和 ISO 頒布的使用斑馬魚進行環境毒性測試的相關標準已經有 10 項。

             2007 年,美國環境保護署(EPA)將斑馬魚技術列入其轉化毒理學研究項目 ToxCast TM。中國也已經頒布了使用斑馬魚進行環境毒性測試的 10 項相關標準。

             ISO-15088-2008     

             Determination of the acute toxicity of waste water to zebrafish eggs 

             

             OECD 化學品魚類(斑馬魚)毒性測試標準:     

             OECD 203(1992)Fish acute toxicity test     

             OECD 204(1984)Fish prolonged toxicity test: 14-day study     

             OECD 210(1992)Fish early life-stage toxicity test     

             OECD 305(1996)Bioconcentra-tion: Flowthrough fish test     

             OECD 212(1998)Fish short-term toxicity test on embryo and sac-fry stages     

             OECD 215(2000)Fish juvenile growth test     

             OECD 229(2009)Fish short-term reproducti-on assay    

             OECD 230(2009)21-Day fish screening assay:A Short-Term Screening for Oestrogenic and Androgenic Activity, and Aromatase Inhibition     

             OECD 236(2013)Fish Embryo Toxicity (FET) Test  


             中國化學品、環境魚類(斑馬魚)毒性測試標準:     

             GB/T 13267-1991 水質 物質對淡水魚 (斑馬魚) 急性毒性測定方法     

             GB/T 21281-2007  危險化學品魚類急性毒性分級試驗方法     

             GB/T 21858-2008  化學品 生物富集 半靜態式魚類試驗     

             GB/T 21800-2008  化學品 生物富集 流水式魚類試驗     

             GB/T 21806-2008  化學品 魚類幼體生長試驗     

             GB/T 21807-2008  化學品 魚類胚胎和卵黃囊仔魚階段的短期毒性試     

             GB/T 21808-2008  化學品 魚類延長毒性 14 天試驗     

             GB/T 21814-2008  工業廢水的試驗方法 魚類急性毒性試驗     

             GB/T 21854-2008  化學品 魚類早期生活階段毒性試驗     

             GB/T 21858-2008  化學品 生物富集 半靜態式魚類試驗     

             GB/T 27861-2011  化學品 魚類急性毒性試驗     

             GB/T 31270.12-2014 化學農藥環境安全評價試驗準則 第 12 部分:魚類急性毒性試驗     

             GB/T 35517-2017 化學品 魚類生殖毒性短期試驗方法     

             GB/T 35515-2017 化學品 魚類雌激素、雄激素和芳香酶抑制活性試驗方法

             GB/T 31270.12-2014 化學農藥環境安全評價試驗準則 第 12 部分:魚類急性毒性試驗 


            近十幾年來,隨著轉基因技術的發展和應用,轉基因斑馬魚也逐漸應用于水質監測,其對污染物的作用反應快,可在短時間內調查水污染狀況或用于特定污染物的檢測。將目標質粒注射到斑馬魚體內,斑馬魚經過篩選得到穩定的轉基因品系,通過觀察熒光蛋白可以用來快速檢測不同的環境污染物: 


            銀納米粒子因其抗菌作用而廣泛應用于洗滌劑和廢物處理領域,為了研究銀納米粒子對環境和健康的影響,來自新加坡國立大學化學系的研究者用斑馬魚作用模式生物評價了銀納米粒子對斑馬魚的毒性,結果顯示銀納米粒子可造成斑馬魚胚胎死亡、體軸異常、脊索扭曲、血流減慢、心包水腫、心律不齊等: 與常規物理和化學檢測手段相比,應用斑馬魚進行環境監測和化學品研究能實現快速、高效、靈敏、成本低等優點。 


      七、總結 

             斑馬魚作為一種小型脊椎類模式生物,很好地彌補了傳統體外細胞學等生物檢測方法與哺乳動物實驗檢測中間的生物學鴻溝,有助于將體外實驗結果更好與體內實驗結果相結合,提高科學研究的效率和質量。同時,斑馬魚自身獨特的生物學特征,也為我們探究和深入理解人體生命奧秘帶了極大的便利。相信隨著更多新技術、新方法的出現以及相互融合,斑馬魚能夠在整個廣義的生命科學研究中發揮更大的作用和價值。

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